本发明公开了一种特异性检测TW I型传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒中至少含有两套引物和探针之一，其中第一套检测引物如SEQ ID NO.8－9所示，探针序列如SEQ ID NO.10所示，所述荧光探针5和3’端分别标记6-FAM基团和MGB基团；第二套检测引物如SEQ ID NO.11－12所示，探针序列如SEQ ID NO.13所示，所述荧光探针5和3’端分别标记6-FAM基团和MGB基团。本发明的试剂盒敏感性高，特异性好，重复性好，能特异性检测TW I型IBV，对于TW I型IBV临床病例快速鉴别诊断和流行病学监测具有重要意义。