本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种辛基酚和壬基酚同分异构体的分离检测方法。本发明的分离检测方法包括以下步骤：将待测样品、水、甲醇混合进行浸提，然后得浸提液；然后将浸提液采用固相萃取柱净化并过滤，得待测样品溶液；采用超高效液相色谱‑串联质谱法对待测样品溶液进行检测，所用流动相为甲醇和体积分数为0.1％的氨水，洗脱方式为等度洗脱；然后根据标准工作曲线计算待测样品中辛基酚和壬基酚同分异构体的含量。本发明的分离检测方法前处理简单，净化效果好，快速、准确地实现了辛基酚以及壬基酚各同分异构体的定性以及定量分析。