本发明提供了一种白眉蛇毒血凝酶特征多肽及其在注射用蛇毒血凝酶种属鉴别中的应用，待测样品及特征肽对照品分别溶解制成供试品及对照品溶液，经二硫苏糖醇及碘乙酰胺还原烷基化处理；碳酸氢氨溶液稀释后，加入酶进行水解；酶解结束后，高速离心，取上清液注入液相色谱-质谱仪进行分析。采用酶解结合液相色谱-串联质谱-多反应监测(LC-MS/MS-MRM)方法，以三电荷935.8→861.4和三电荷935.8→602.3作为检测离子对提取离子流色谱图，对注射用白眉蛇毒血凝酶进行种属鉴别。该方法简便快捷，专属性强，填补了注射用白眉蛇毒血凝酶种属来源鉴定的空白，提高了质量控制水平。