本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除TNFα基因的sgRNA和敲除TNFα基因的猪胚胎成纤维细胞系及其应用；本发明提供的TNFα基因敲除的sgRNA在TNFα基因上的靶点序列位于其第一外显子上，靶点序列如SEQ ID NO：1所示。在将所述sgRNA构建至载体pX330后，将表达载体pX330-TNFα作为TNFα基因的打靶载体，转染猪胚胎成纤维细胞，获得TNFα基因敲除的猪胚胎成纤维细胞单克隆细胞株，得到的多种不同编辑类型的突变体均可造成移码突变，编辑效率较高。本发明制备得到的猪胚胎成纤维细胞细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，具有较大的应用研究价值。