本发明提供一种利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建伪狂犬病毒复制非必需基因插入突变，并获得表达外源基因的重组伪狂犬病毒的方法。本发明将CRISPR/Cas9基因编辑系统导入细胞后，通过预先筛选的靶序列识别病毒基因组，对感染细胞的伪狂犬病毒基因进行编辑和重组。该方法构建的重组伪狂犬病毒在特定基因部位插入目的外源基因，而不影响病毒自身的复制，且构建过程中利用标记正向或反向筛选重组病毒，显著提高了重组病毒的获得效率，为构建表达外源基因的重组伪狂犬病毒疫苗奠定了基础。本发明基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建的重组伪狂犬病毒的方法可用来快速构建重组病毒活载体疫苗，具有重要的应用价值。