本发明涉及细胞分离技术领域，具体公开了一种原代肝实质细胞的分离提取方法及其应用。本发明的方法为将灌注液Ⅰ和灌注液ⅠⅠ注射在肝组织块中，以消化分离肝实质细胞获得细胞悬液，之后，将所述细胞悬液经过滤后获得的滤液依次进行5次常温离心，离心条件依次为1000‑1580rpm/min×3‑5min、500‑650rpm/min×3‑5min、200‑300rpm/min×4min、200‑300rpm/min×4min、200‑300rpm/min×4min。本发明操作简单，耗时少，无需低温离心设备，能高效去除红细胞和细胞碎片，获得的肝实质细胞存活率和纯度较高。