本发明提供了一种蜂花粉中生物毒素的检测方法及其应用，所述检测方法包括以下步骤：(1)样品提取：将粉碎、均质后的蜂花粉样品中加入提取溶剂进行提取，然后加入盐析剂，混匀后离心，将离心后的上清液作为样品提取液；其中该提取溶剂包括乙腈、水和甲酸溶液，所述乙腈、水和甲酸溶液的体积比为75:20:5；(2)样品净化：将所述样品提取液加入净化柱中净化、进一步过滤得到目标检测液；(3)样品检测：将所述目标检测液置于超高效液相色谱‑三重四级杆串联质谱仪中进行分析检测。该检测方法实现了蜂花粉中10种生物毒素的高通量检测，分析时间短，定性、定量检测结果稳定可靠。