本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于DNA循环迭代组装的系统及方法。本发明的循环迭代策略采用四个供体质粒循环利用，采用四个Cas9切割位点和两个筛选标记的设计；本发明中Cas9基因、λRed系统、telN基因是采用质粒形式实现，Cas9基因、λRed系统、telN基因整合到大肠杆菌基因组上可以的达到同样DNA组装的效果。该方法一方面不需要对DNA进行繁琐的体外抽提、酶切、回收等操作，另一方面避免传统大片段DNA组装需要制做原生质体等感受态细胞过程，具有操作简单自动化程度高、成本低等优点。该方法连续组装4轮后，5个DNA片段的组装阳性率可达98.4％，具有DNA组装阳性率高的优点。