本发明涉及生物细胞技术领域，尤其为一种用于脐带间充质干细胞的冻存保护液制备工艺，包括以下步骤：首先将脐带组织进行剪开和铺开，然后使用消毒液对脐带组织的表面进行清理；对脐带组织进行剪碎处理，然后对剪碎之后的脐带组织内加入胰酶和EDTA进行消化处理；对酶解消化后的细胞进行离心处理然后在完全培养基重选后，进行密度传代；对液体进行离心处理；对离心得到的上清中进行加入二甲基亚砜，然后进行混合处理，再转入液氮中进行长期的保存处理，本发明中，通过上述技术工艺，不仅可以有效的避免牛血清的使用，从而尽可能少引入异源的病毒和致敏源，而且可以有效的提高脐带间充质干细胞的冻存保护液的质量。