本发明公开了一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用，包括以下步骤：1)菌体裂解；2)镍柱亲和纯化；3)酶切；4)镍柱穿透；5)C18‑100A柱纯化；6)C18‑300A反向色谱纯化；7)旋蒸与冻干。本发明提供的可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用，采用镍亲和层析法从表达产物中分离Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白，再用酶切将重组特立帕肽从Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白中释放出来，通过三步层析方法制备纯化的重组特立帕肽，简化了纯化过程，提高了可溶性重组特立帕肽的纯化效率与纯度，对制备治疗骨质疏松症和骨折患者药物的原料药重组特立帕肽有重要帮助。