本发明公开了一种用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的实时荧光RT‑RPA引物、探针和试剂盒及其应用。本发明通过基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒特定的保守区域设计筛选得到引物和探针的最佳组合，其检测灵敏度高、特异性好、检测效果稳定；而且与包括Ⅰ型GCRV和Ⅲ型GCRV在内的9种鱼类常见病毒和草鱼易感染细菌维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌均无交叉反应，表现出良好的特异性。基于本发明所建立的实时荧光RT‑RPA引物、探针及检测试剂盒，对于基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒检测灵敏度为101copy/μl，检测灵敏度比巢氏PCR方法高10倍，不需要大型仪器设备，检测时间仅需4.5～30min，大大缩短了检测时间，可用于现场快速检测。