本发明属于生物病原体检测技术领域，具体涉及一种检测蜂房球菌的特异性PCR扩增引物对、检测方法及应用。该检测方法先提取蜜蜂幼虫DNA，然后使用引物对WxlF2：5′‑ACTGATCCAACAGATCCAAC‑3′，WxlR2:5′‑TCCCTTAAAGTCAGACAAGC‑3′；或WxlF3：5′‑AACAGATCCAACTGGTCAAA‑3′，WxlR3：5′‑CTTAAAGTCAGACAAGCCGA‑3′进行PCR扩增，最后进行电泳观察扩增情况从而判断是否携带蜂房球菌。该检测方法不用分离蜂房球菌单菌落，简单易行，而且PCR扩增时间可控制在1h以内，可满足欧洲幼虫腐臭病的快速检测需求。