本发明属于荧光分析技术领域，涉及一种含四元螺环结构的荧光染料，制备方法和应用。具体涉及一种含氮杂环丁烷螺环结构的荧光染料，及其制备方法和应用。本发明的含氮杂环丁烷螺环结构的荧光染料，具有如下(Ⅰ)或(Ⅱ)的骨架结构，本发明的含氮杂环丁烷螺环结构的荧光染料具有优异光学特性、良好光稳定性、良好生物相容性、本发明还提供了具额外化学连结位点的新型含氮杂环丁烷螺环结构荧光染料，制备方法和在生物荧光分析上的应用。所述荧光分子显示出良好的水溶性，光稳定性，高荧光量子产率，可用于荧光标记，生物成像和开发新的荧光探针。