本发明公开了一种多重数字化ELISA检测方法及微流控芯片，该微流控芯片包括顶层芯片以及分别与其组合使用的微球分区排布芯片和尺寸颜色双重编码的微球。微球分区排布芯片设有平行排布的不同半径尺寸间隔的微柱阵列，每个尺寸的微柱阵列为对应尺寸微球的捕获区域，微球表面为检测的固相表面。尺寸颜色双重编码的微球通过不同半径尺寸与两种颜色不同比例的混合叠加，构建高通量的双重分类编码微球。微球表面为检测的固相表面，通过尺寸和颜色双重编码，颜色的特征通过不同种颜色不同比例混合获得。每种微球对应一种靶标，实现大规模多靶标的同时检测，解决单一靶标检测中样品和劳力消耗大、时间和经济成本高的问题。