本发明公开了一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，一是通过反应体系充分反应，得到待测样品溶液；二是使用全波长酶标仪对待测样品溶液进行吸光度进行检测，得到样品溶液的吸光度值；三是以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并以样品溶液的吸光度值对照标准曲线得到对应胆碱物质的量；四是通过定义酶活并通过公式计算得到酶活数据。本发明中优化了磷脂酶D酶活性测定方法，解决了现有的酶联比色法中关于底物溶解、反应条件、终止反应、以及数据取得的问题，利用该方法测定磷脂酶D的酶活性用时短、操作简便、灵敏度高、重复性好、实用性强，并且确定了反应中所用试剂组成，有望进一步开发形成商品化试剂盒。