本发明公开了一种香蕉炭疽病菌的分离方法。该方法采用一种特制的孢子离散丝，直接从香蕉炭疽病标样中将单个分生孢子分离出来，培养形成一个遗传组成单一的香蕉炭疽病菌菌株。分离培养的实施操作步骤如下：1)香蕉炭疽病标样的准备；2)孢子离散丝的制备；3)孢子离散板的制备；4)分生孢子的离散；5)载有单孢子小方块的切取；6)单孢子分离菌株的形成。本发明具有如下优点：1)分离孢子用的关键器具简单易制，分离操作简单易行；2)分离与取得单孢菌株能一次到位；3)分离工作耗工少耗时短；4)能显著提高香蕉炭疽病菌分离的工作效率及分离结果的可靠性。