本发明提供了一种表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株及其制备方法与应用，所述表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒株的保藏编号为CCTCC NO:V202148。本发明由II型单纯疱疹病毒蛋白优势表位整合入流感病毒基因组NS片段中组成的重组流感病毒，首次以流感病毒为载体表达II型单纯疱疹病毒蛋白；本发明的表达II型单纯疱疹病毒蛋白的重组流感病毒可以在宿主细胞或鸡胚中稳定传代，可以用于II型单纯疱疹病毒疫苗的开发、相关药物的开发以及利用细胞或鸡胚作为生物反应器生产II型单纯疱疹病毒蛋白。