本发明提供了一种利用油茶粕发酵制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，步骤如下：(1)油茶粕的生物脱毒预处理：利用黑曲霉于28～38℃发酵油茶粕4～6天，之后进行蒸汽爆破处理，得到脱毒油茶粕；将脱毒油茶粕粉末与水混合，灭菌后得油茶粕液体培养基；(2)发酵菌群的驯化及富集；(3)油茶粕发酵；(4)生物表面活性剂的提纯。本发明利用低温窖藏腌制素菜的老盐水中富集、筛选和驯化的酵母菌群，得到具有表面活性剂合成能力的菌剂，并以此菌剂对生物发酵预处理后的油茶粕进行发酵，可制备出优良的生物表面活性剂，制备出的表面活性剂可使液滴直径提高27.5％，乳化指数可达63.0％，表面张力下降49.21％。