本发明公开了一种同时检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR试剂盒及其应用。所述的三种分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合群(MTBC)、禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)和禽分枝杆菌禽亚种(MAA)。所述的试剂盒中含有分别用于检测MTBC、MAP和MAA的引物以及探针。进一步的，本发明还建立了使用上述试剂盒检测三种分枝杆菌的多重TaqMan荧光定量PCR方法，实验证明，本发明建立的多重TaqMan荧光定量方法与常规PCR的阳性符合率为100.0％(175/175)、阴性符合率为87.0％(220/253)，与分枝杆菌培养的阳性符合率为100.0％(116/116)、阴性符合率为69.6％(220/316)。因此，本发明所建立的多重TaqMan荧光定量方法可用于MTBC、MAP和MAA的定性和定量检测，为有效防控牛结核病和副结核病提供了新的技术手段。