本发明提供了一种包载抗原的阳离子纳米乳佐剂、及其制备方法和应用，该佐剂含有双亲性阳离子材料和水包油型纳米乳。其中，双亲性阳离子材料修饰在纳米乳佐剂表面，并通过双亲性阳离子材料介导的静电吸附作用、范德华力、氢键等作用力下实现抗原包载，该阳离子纳米乳佐剂实现抗原与佐剂的共载和协同递送，能够消除抗原与佐剂向淋巴结引流中时间和空间上的分离，同时具有克服生理屏障的能力，可有效地应用于皮下、皮内、肌肉注射等注射免疫途径，以及鼻腔、阴道、胃肠道等黏膜途径免疫，提高疫苗体内免疫效力。本发明提供的包载抗原的阳离子纳米乳佐剂的制备方法简单易行、条件温和、生产成本低、免疫效果好。