本发明提供了一种坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别方法，属于土壤微生物学技术领域，包括：确定坡耕地垄沟布局参数；布设实验小区和对照小区；进行土壤微生物高通量测序，得到土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据；确定对所述土壤微生物群落结构多样性相关指数和土壤碳氮循环过程功能基因丰度数据产生影响的坡耕地垄沟布局参数的主次顺序；构建线性回归方程；对所述线性回归方程进行显著性检验，完成对坡耕地垄沟布局对微生物影响机理的识别。本发明选择四种具有代表性的垄沟布局参数，通过高通量测序技术对不同垄沟布局下土壤微生物群落多样性进行分析，识别坡耕地垄沟布局对土壤微生物影响机理，为制定合适的坡耕地垄沟布局方式提供参考。