本发明提供了一种Y染色体AZF区域微缺失检测的方法、引物组合物及试剂盒，引物组合物包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物，第一引物组合物依据至少1个常染色体上若干个特异性内参位点设计形成；第二引物组合物依据Y染色体上至少1个特异性内参位点设计形成；第三引物组合物依据Y染色体AZF区的至少1个引物位点设计形成。引物组合物中引入了常染色的特异性内参位点设计引物，可有效避免由于Y染色体的拷贝数≠1引起的检测错误，同时本发明的方法可同时对X和Y染色体提进行检测，大大提高了Y染色体AZF区域微缺失检测的准确度。