本发明公开了一种RNA解旋酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用。其中所述突变体的多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第236位亮氨酸突变为精氨酸。本发明以RNA解旋酶cshB为基础，选择第236位的氨基酸进行定点突变，将枯草芽孢杆菌BS‑1中RNA解旋酶编码基因cshB变为RNA解旋酶突变体(L236R)与枯草芽孢杆菌BS‑1相比，含有RNA解旋酶突变体(L236R)的菌株可以提高产维生素B2的能力达11.5％，因而在制备维生素B2中具有很大的应用价值。