本发明公开了一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法，包括如下步骤：S1、引物设计及合成；S2、引物退火；S3、sgRNA重组质粒构建；S4、转化得到24份2μl的混合物；S5、筛选单克隆；S6、质粒提取及测序。该方法优化了重组质粒的构建步骤和转化实验的孵育步骤，同时缩短了质粒构建和转化实验的时间提高了转化效率和阳性率，减少了实验成本，在筛选单克隆过程中替换了传统的涂布棒法，为最终实现自动化、高通量sgRNA载体构建奠定了基础；解决了酶切和连接的矛盾，将不可能统一的体系实现了统一，该方法不仅能够应用于基因编辑sgRNA的构建，还可以应用于载体构建的无缝克隆技术。