本发明公开了一种生物窗口内激发/发射的超亮单色上转换纳米探针及其制备方法和应用，属于稀土发光纳米材料的制备及生物活体成像技术领域。本发明提供的纳米探针是由Nd3+、Yb3+、Er3+和Mn2+共掺杂形成的具有多层核壳结构的纳米颗粒，其化学组成为α‑NaYF4:Yb/Er/Mn@CaF2:Yb@NaNdF4:Yb。本发明通过组分优化和结构设计，所制备的上转换探针材料在808nm近红外光激发下获得高量子效率的单谱带红光发射。本发明的上转换荧光探针材料结构独特、性能稳定，应用于小鼠活体成像分析具有高组织穿透深度和高灵敏、高分辨及高信噪比等优点，在生物成像方面具有很好的应用前景。