本发明涉及基因工程和微生物领域，具体公开了伊短菌素高产工程菌及应用。该工程菌以野生型短短芽孢杆菌为原始菌株，将启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle‑09和P43与抗性基因ApraR连接，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌中伊短菌素生物合成基因簇的天然启动子Pede分别替换为启动子Pgrac、Pspc、Pshuttle‑09和P43，得到相应的高产伊短菌素的短短芽孢杆菌工程菌。通过所述定向遗传修饰的短短芽孢杆菌工程菌能够提高伊短菌素的产量，培养方式简单、生产效率高，为实现伊短菌素在微生物源农药和医药中的开发与利用奠定了坚实的基础。