本发明提供了一种2,3‑二苯甲酰氧基‑4‑二甲基氨基‑4‑氧代丁酸的手性分离检测方法，属于分析检测方法领域。本发明提供的分离检测方法，包括：包括如下步骤：使用稀释剂溶解待测样品，得待检测液；使用正相高效液相色谱法对待检测液进行检测，正相高效液相色谱法的色谱条件为：IC 4.6×250mm，5μm手性色谱柱，流动相由流动相A和流动相B组成，紫外检测波长为220nm‑260nm，流速为0.5mL/min‑1.5mL/min，柱温为25℃‑35℃，流动相A为含有添加剂的乙醇，流动相B为正己烷，添加剂选自三乙胺、三乙醇胺以及甲酸中的任意一种或多种，洗脱程序为流动相A与流动相B的体积比为(60‑70)：(30‑40)。本发明能够简单有效地分离检测，而且峰型良好，分离度高。