提供了一种基于RNA样本构建文库的方法及应用。该方法包括：(1)将所述RNA样本进行逆转录反应，以便获得DNA‑RNA杂合链；(2)将所述DNA‑RNA杂合链和核糖核酸内切酶、第一DNA聚合酶、第二DNA聚合酶以及dATP反应，获得末端加dA的双链DNA，所述第一DNA聚合酶具有5’‑3’外切酶活性和3’‑5’外切酶活性，所述第二DNA聚合酶不具有3’‑5’外切酶活性；(3)将所述末端加dA的双链DNA与测序接头连接，以便获得连接产物；(4)将所述连接产物进行PCR扩增，以便获得测序文库。