本发明公开了基于RT‑RAA荧光方法检测乙型脑炎病毒的试剂和试剂盒。所述试剂盒包括检测乙型脑炎病毒的组合物；所述组合物包括引物JEV‑RAA‑F2、JEV‑RAA‑R1和探针；所述引物JEV‑RAA‑F2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述JEV‑RAA‑R1的核苷酸序列如序列3所示；所述探针的核苷酸序列如序列4所示。该试剂盒只需39℃条件下反应30min就可以准确检测出待测样本中是否含有乙型脑炎病毒，且具有很高的灵敏性和特异性，最低检测极限为5.5×101copies/μL的JEV阳性标准质粒转录本，可以应用于临床中乙型脑炎病毒的快速高效检测，具有良好的应用前景。