本发明公开了一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541及其制备方法与应用。本发明通过基因工程将Ag85A蛋白和Ag85B蛋白抗原表位，Rv3407和Rv1733c的表位基因融合在一起，并连接到真核表达载体pVAX1上，构建得到的多抗原免疫优势表位的新型结核分枝杆菌DNA疫苗。本发明所制备的结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541，可显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，主要刺激Th1型的免疫反应，治疗小鼠结核潜伏感染模型可使其肺、肝脏组织细菌数减少，肺组织病变范围显著减少，病变减轻。本发明制备的疫苗在结核潜伏感染者的预防性治疗方面将具有广阔的应用前景。