本发明公开了一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源MLKL基因缺失细胞株及其应用，属于生物技术领域。本发明公开了用于敲除猪源MLKL基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的引物序列如SEQ ID NO：1‑2所示；所述sgRNA2的引物序列如SEQ ID NO：3‑4所示。利用上述的sgRNA引物以及CRISPR/Cas9载体构建敲除猪源MLKL基因，再采用有限稀释法对所得的敲除猪源MLKL基因的猪肾上皮细胞进行传代、筛选，得到猪源MLKL基因缺失细胞株，将其接种伪狂犬病毒后，该细胞株与正常猪肾上皮细胞相比能持续促进病毒增殖。