本发明提供一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器、制备方法及应用，属于电化学分析领域。所述电化学酶生物传感器是由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料与乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面制备而成，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料以多壁碳纳米管为载体，在载体表面形成共价有机框架材料。采用三电极体系，即参比电极为银/氯化银电极，对电极为铂丝电极，工作电极由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料和乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面组成，采用差分脉冲伏安法对马拉硫磷进行检测。本发明构建的电化学酶生物传感器具有灵敏度高、制备方法简单、选择性高等优点，在有机磷农药残留的检测领域有很好的应用前景及价值。