本发明涉及一种RPA等温扩增和免疫层析技术相结合的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒，属于疾病检测领域。本发明针对PRV的gE基因，通过筛选获得一组具有很高RPA扩增效率的引物探针，进一步结合免疫层析技术建立了胶体金试纸条RPA检测方法，实现了PRV感染的临床快速检测。同时样品通过高温处理即可实现核酸模板的制备，极大降低整个检测成本，缩短检测时间。该方法具有良好的特异性，灵敏度可达21个拷贝/反应或者6×100TCID50/反应；临床样品检测显示，本发明和国标GB/T35911‑2018推荐的PRV检测方法结果完全一致，具有较好的实际应用价值。