本发明公开了一种复制缺陷型伪狂犬病病毒构建方法和应用。所述的复制缺陷型伪狂犬病病毒是在包含PRV全基因组的BAC感染性克隆的基础上，将其中的gB基因编码序列中的第151或196位精氨酸突变为终止密码子TGA后得到的。本发明用tRNA反密码子编辑(Anticodon‑engineeredtransferRNAs，ACE‑tRNAs)技术实现DNA病毒提前终止密码子(Prematurestopcodon，PTC)的高效通读并应用于动物病毒疫苗的研究。证明了基于ACE‑tRNAs技术研究的复制缺陷病毒作为疫苗应用的可行性。本发明的提出为伪狂犬病病毒的防治提供了一种新的技术手段，同时也为解决一直困扰人们的疫苗安全性和有效性的问题提供了一种新的思路，代表了一种有前途的疫苗研究工具，为其它疫苗研究困难的病毒新型疫苗开发打开一扇新的大门。