本发明公开了一种暗纹东方鲀精巢细胞系及其构建方法和应用，采用物理剪切配合胰酶消化法分离精巢组织细胞，进行原代培养，并在传代培养中，利用富营养培养基传代培养，继而成功构建了暗纹东方鲀精巢细胞系。本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞呈现上皮细胞形态，已连续培养超过100代，可提供大量的暗纹东方鲀精巢细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本发明提供的暗纹东方鲀精巢细胞系可直接用于暗纹东方鲀性别分化和发育相关基因表达调控研究，还可以作为暗纹东方鲀功能基因的体外研究平台。建立暗纹东方鲀精巢细胞系的应用价值显著，不仅有利于河鲀性别分化和发育相关领域的科学研究，也有利于促进暗纹东方鲀养殖产业的发展。