本发明公开了一种河豚鱼皮抗冻肽及其制备方法和应用，属于抗冻肽技术领域。所述河豚鱼皮抗冻肽的氨基酸序列为EGPRAGGAPG或GDAGPSGPAGPTG或GEAGPAGPAG。本发明利用酶解技术获得河豚鱼皮酶解液，采用冰亲和吸附装置、SP‑Sephadex C‑25阳离子交换色谱和Sephadex G‑25凝胶过滤色谱分离抗冻活性最强的组分，最后借助计算机方法进行活性的辅助筛选，获得3个具有无毒性、亲水性及冷冻保护活性的河豚鱼皮抗冻肽。本发明所述所述河豚鱼皮抗冻肽可用作食品、低温组织工程、生物医药等领域中的冷冻保护剂，具有广阔的应用前景。