本发明中公开了一种复合微生物菌剂，包括以下重量份数的原料：微生物菌粉20～50份、生长辅料50～80份、干燥剂5～10份；所述微生物菌粉包括镰刀菌、淡紫拟青霉、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。本发明同时提供上述复合微生物菌剂的制备方法及其在防治棉花黄萎病中的应用。本发明将内生拮抗真菌镰刀菌和淡紫拟青霉与土壤有益细菌解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌进行组合，组成一个复合微生物组群，可以显著提高对于棉花黄萎病的防治效果，从而提高棉花经济效益；而且本发明中的复合微生物菌剂为生物防治制剂，其对环境无污染，且制备工艺简单，易于操作，成本低廉，适于在棉花生产中大规模应用。