本发明公开了一种多层次严格调控自杀蛋白rCas8活性系统及其应用，该系统包括重组自杀蛋白rCas8、促进重组自杀蛋白rCas8激活的“自杀辅助元件”、保护细胞的“保护元件”以及RNA转录后的“调控元件”；其中，所述“自杀辅助元件”包括链霉亲和素；所述“保护元件”包括烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶、Strep‑TagⅡ、缺失Strep‑TagⅡ结合能力的突变型链霉亲和素；所述RNA转录后的“调控元件”包括转运蛋白Rev、在mRNA转运过程中降解mRNA的Rev‑RNase。本发明基于通过多层次调控细胞死亡相关蛋白，使其能精准杀死靶标细胞，而对正常细胞具有保护作用。