本发明公开了酰胺水解酶突变体及其应用。该酰胺水解酶突变体是对野生型酰胺水解酶进行突变得到的蛋白质，所述野生型酰胺水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1第1‑509位所示，所述蛋白质为下述A)或B)：A)所述蛋白质的氨基酸序列与野生型酰胺水解酶的氨基酸序列相比，如下至少一种氨基酸残基进行突变：所述野生型酰胺水解酶第146位的苯丙氨酸残基、第193位的甘氨酸残基、第198位的异亮氨酸残基、第223位的异亮氨酸残基、第328位的色氨酸残基、第332位的丙氨酸残基和第450位的异亮氨酸残基，B)所述蛋白质为将A)所示蛋白的氨基酸序列末端添加蛋白标签序列且具有酰胺水解酶活性的由A)衍生的蛋白。该酰胺水解酶突变体可被用于合成高光学纯度的手性环状化合物。