本发明公开了一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及提高米黑根毛霉脂肪酶活性和/或甲醇耐受性的方法。本发明在米黑根毛霉脂肪酶成熟肽的β‑sheet二级结构中引入糖基化修饰，获得了高活性高甲醇耐受性的脂肪酶突变体。与改造前相比，本发明产生的突变酶P167N，L242N，R267N和P300N酶活分别提高了33.90，17.90，14.07和12.26倍。当在60％的甲醇溶液中孵育1h后，突变酶残余活力由改造前的19.10％提高到60％以上。本发明产生的突变酶实现高效利用废油脂一步甲醇法制备生物柴油，这不仅提高了反应效率，缩短了反应时间，还简化了反应工艺。