本发明公开了异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用。具体制备工艺：提取、硅胶柱前处理、微孔树脂柱富集、在线自由基清除剂组分筛选、Diol二醇基柱富集、在线自由基清除剂组分再筛选、反相制备柱制备及反相制备液相色谱纯化。制备工艺中的提取溶剂、硅胶柱、微孔树脂柱、Diol二醇基柱、反相色谱柱所使用的溶剂及分离材料均可回收利用；原料成本低，甲醇室温冷浸提取，硅胶和微孔树脂分离材料可装于中压柱层析系统中，实现规模化操作；高压色谱分离纯化可以保证产品的纯度大于95％。