本发明属于生物化学领域，具体公开了一种检测内源性H2O2和H2S共存及交替存在的荧光探针及其制备方法和应用，所述有机荧光探针具有式Ⅰ所示结构。本发明中所提供的有机荧光探针具有非常优良的近红外荧光性能，能够在H2O2和H2S同时存在时开启近红外荧光发射，并且在接下来的H2O2和H2S交替存在时顺序关闭和开启荧光发射，首次实现了内源性H2O2和H2S共存和交替存在的荧光可视化，在生物化学及医学领域的荧光成像中有着及其可观的应用前景。本发明提供的荧光探针合成方法简单，成本相对低廉。