本发明属于生物技术领域，具体涉及高粱炭疽菌分离鉴定及致病性测定的方法。为精准鉴定出高粱病原、评估不同病原菌菌株的致病性及高粱品种的抗病性。本发明用梯度稀释法结合光滑的挑针从清水琼脂块上挑取单个孢子转移到PDA培养基上，待孢子萌发后再转移至新的PDA培养基上获得纯化菌株，结合其形态特征和ITS序列快速鉴定病原菌种类。再采用病原菌孢子悬浮液对高粱叶片进行离体划伤接菌或活体喷雾接菌，根据观察，记录叶片病斑数和病斑面积，计算出叶片平均病斑数目和叶片病斑面积比率，从而筛选出高粱炭疽菌抗原。为高粱炭疽病发病机理和抗病基因挖掘提供研究方法依据。