本发明公开了一株稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将一段C38‑mCherry‑T2A基因序列SEQ ID NO.1插入到GI型日本脑炎病毒基因组的5′UTR与C基因之间，构建获得含有T7启动子的重组病毒感染性克隆。利用体外转录技术获得重组病毒的基因组RNA全长，并转染至BHK‑21细胞中，当细胞出现典型的病变时，收取细胞上清即可获得表达mCherry蛋白的重组病毒。该重组病毒能够稳定高效地表达mCherry蛋白，插入的mCherry基因在病毒连续传代过程中具有遗传稳定性，且不影响病毒蛋白的翻译、加工以及病毒的复制能力。本发明所述的稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒在抗病毒药物筛选方面具有广泛的应用价值。