本发明提供了一种铜绿假单胞菌检测方法及试剂盒。所述方法包括如下步骤：S1、将待测样品与半乳糖改性磁性纳米粒子置于分散系中混合，得到混合分散系；S2、将步骤S1所述混合分散系置于磁场内，通过磁分离得到磁性物质；S3、将步骤S2所述磁性物质与载有荧光分子的明胶酶敏感粒子置于无菌液体培养基中培养，得到培养液；S4、将步骤S3所述培养液离心，得到上清液；S5、测定步骤S4所述上清液的荧光强度，根据荧光强度判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌。本发明提供的检测方法基于半乳糖与铜绿假单胞菌表面的特异性相互作用以及铜绿假单胞菌代谢明胶酶的特征，实现了铜绿假单胞菌的快速检测。