本发明提供了一种阿糖类核苷一锅法生物合成的方法及组合物。其中，阿糖类核苷一锅法生物合成的方法包括：底物、尿嘧啶核苷磷酸化酶或嘧啶核苷磷酸化酶、以及嘌呤核苷磷酸化酶，共同混合后进行生物合成，一锅法直接制备获得阿糖类核苷。尿嘧啶核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：1所示的UP；嘧啶核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：2所示的PyNP；嘌呤核苷磷酸化酶包括SEQ ID NO：3所示的PNP；底物包括阿糖尿苷和底物碱基。能够解决现有技术中生物合成两步法制备阿糖类核苷操作复杂的问题，适用于酶催化领域。