本发明公开了一种具有脂滴和线粒体双色成像功能的单分子荧光探针及其制备方法和应用。本发明的单分子荧光探针，其结构如式(Ⅰ)所示：其中，R‑选自碘离子、溴离子、氯离子、对甲苯磺酸离子、三氟甲磺酸离子中的至少一种。该单分子荧光探针能够同时靶向脂滴和线粒体并发出不同颜色荧光，其中在脂滴内的激发波长是405nm，使脂滴显示出青色荧光，在线粒体内的激发波长是561nm，使线粒体显示出红色荧光。此外采用本发明的探针能够实时监测活细胞或活体内脂滴和线粒体的动态变化，对研究脂滴和线粒体的相互作用具有重要意义。