本发明提供了一种复合佐剂、疫苗及制备方法，属于疫苗技术领域；所述复合佐剂包括以下质量份的组分：CpG‑ODN(5～100)×10‑3份、氢氧化铝0.2～1.2份和甘氨酸1～5份。本发明的复合佐剂中CpG‑ODN和氢氧化铝具有优异的抗体效价提高能力，甘氨酸能够提高抗原的稳定性。将EV71灭活病毒与本发明的复合佐剂混合后，EV71灭活病毒在4℃条件下保存180天，EV71灭活病毒的含量仅下降了5％～7％，而无甘氨酸组EV71灭活病毒的含量下降10％～20％。