本申请涉及一种寡核苷酸氨解方法，该方法包括以下步骤：向连接有寡核苷酸的固相载体中加入第一氨解处理液进行洗脱处理，得到第一处理液；洗脱处理的时间为30min～120min，洗脱处理的温度为18℃～28℃；将第一处理液在密封条件下加热进行氨解反应，得到氨解后的寡核苷酸；其中，第一氨解处理液包括叔丁胺、甲醇和水，叔丁胺、甲醇和水的体积比为1：(0.8～1.2)：(1～6)。上述寡核苷酸氨解方法中，通过控制洗脱时间及氨解处理液的特定组分和配比，使得叔丁胺与甲醇相互配合，将合成的寡核苷酸从固相载体上切割下来，再密封进行氨解，减少了对寡核苷酸结构的破坏，有利于获得纯度高、产率高的寡核苷酸产品。