本发明提供了一种单微球空间限域增强的CRISPR/Cas12a传感系统及其应用，所述传感系统包括：单微球空间限域增强反应器和CRISPR/Cas12a体系，所述单微球空间限域增强反应器包括单微球和单链DNA荧光报告探针；所述单微球用于增加局部分子浓度、促进CRISPR/Cas12a反式切割反应效率和负载单链DNA荧光报告探针；所述单链DNA荧光报告探针用于输出荧光信号；所述CRISPR/Cas12a体系用于特异性识别Activator DNA和通过反式酶切活性水解负载在单微球表面的单链DNA荧光报告探针，在单微球表面产生荧光信号；所述单链DNA荧光报告探针固定在单微球外表面，所述CRISPR/Cas12a体系反式切割反应在单微球空间限域增强反应器表面进行本发明设计简单、无需核酸扩增就可以实现单分子水平目标DNA定量检测。